導讀

        隨著生物制藥的快速發展及監管部門對生物藥的要求越來越高,使得生物制藥的分離純化難度越來越大。層析技術由于具有極高的分離純化效率且應用條件溫和,在分離純化過程中容易保持目標分子的生物活性,因此層析技術已成為生物制藥重要的純化工具。層析介質制備技術難度大,門檻高,目前主要由美國GE、日本Tosoh 及德國Merck 等少數公司壟斷,其中美國GE占全球市場85%以上。中國在高性能層析介質方面長期依賴進口。納微通過10年持續不斷的創新開發出世界領先的單分散高效層析介質的制備技術,成為全球單分散層析介質的多種品種規格的生產廠家,產品包括反相、離子交換、疏水、Protein A 親和層析介質等,可以滿足實驗室的分析檢測和工業化分離純化的需求。
 

一、背景介紹

         基因工程、細胞工程以及酶工程為代表的現代生物技術的迅速發展,使生物制藥獲得前所未有的發展機遇,2015年生物制藥的市場接近2000億美元。生物制藥的生產一般可分為上游發酵過程和下游純化分離過程,因此如何經濟、高效的從復雜組分中濃縮、分離和純化目標生物分子已成為全球生物藥生產的技術瓶頸。在蛋白類生物藥生產過程中,分離成本可占總生產成本的50~80%,分離純化技術還對生物藥的分子形態、收率、質量和成本具有關鍵作用。另外隨著生物藥的日益發展其結構越來越復雜,同時監管部門對生物藥的純度要求越來越高,使得生物制藥的分離純化難度越來越大。由于生物大分子具有結構復雜、穩定性差、濃度低等特點,傳統重結晶、精餾等小分子藥物純化方法不能滿足生物大分子的分離純化。由于液相色譜或層析技術具有極高的分離純化效率,且條件溫和,在分離純化過程中容易保持目標分子的生物活性,因此層析技術已成為生物制藥重要的純化工具。層析介質是生物制藥分離純化系統的心臟,分離效果很大程度上取決于層析介質;用于生物制藥分離純化的層析介質對材料組成、粒徑大小、形態、均勻性、孔道結構、表面功能基團及機械強度都有嚴格的要求。由于層析介質制備技術難度大、門檻高等因素,目前主要由美國GE、日本Tosoh 及德國Merck 等少數公司壟斷,其中美國GE占全球市場85%以上,而中國市場在高性能層析介質方面長期依賴進口。  

二、生物層析介質的性能

        理想的層析介質需要滿足多方面的要求:第一,對目標生物分子分離選擇性好, 分辨率高;第二,層析介質的非特異性吸附低,回收率高, 同時在分離純化過程中 可保持生物分子結構及生物活性;第三,介質要求有較高的有效比表面積及孔徑大小,以滿足生物分離純化對高載量的需求;第四,介質基質及表面功能基團化學穩定性高,在分離純化過程中沒有脫落。并可在寬pH 范圍使用,可在線清洗;第五,層析介質的機械強度要求較高,在重復裝柱的過程中不容易破碎,可耐受一定的壓力和流速以滿足生產效率的要求;第六,層析介質粒徑分布窄,具有完美的球型;第七,層析介質產品性能要穩定,批與批次重復性好;第八,層析介質的性價比要高,可降低生物制藥成本。
用于生物大分子分離純化的層析介質根據材料的組成可分為兩大類: 第一類是天然碳水高分子改性層析介質,包括改性葡聚糖、瓊脂糖和纖維素等;第二類是合成高分子層析介質,包括交聯聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺和聚乙烯醇等。

三種常見的生物大分子分離純化層析介質
 
        天然碳水高分子改性層析介質由于親水性好,生物分子兼容性好,在分離純化過程中容易保持生物大分子的生物活性,因此被用于生物大分子的分離純化,也是目前使用廣泛的生物分離純化介質。天然碳水高分子改性層析介質常稱為軟膠,其缺陷是機械強度差,裝填的柱床高度及耐受壓力和流速都有一定的局限性,因此單位體積的介質純化目標的生物分子效率較低,而且介質只適合裝在矮胖的柱子中。另外軟膠在固態下沒有孔隙,只有在水溶液介質里溶脹下高分子鏈舒展開形成網狀孔隙,生物分子在網狀孔隙結構的軟膠中擴散速度較慢,因此流速對軟膠的動態載量影響較大,流速快時,分子來不及擴散到微球介質里而沿球與球之間的孔隙往下流動,因此在高流速下,流穿較快,動態載量較低。而合成高分子層析介質(也稱為硬膠)不僅具有較強的機械強度,而且其孔道結構與軟膠結構有很大的差別,即使在干燥狀態下,硬膠也有固有的孔隙,硬膠的孔隙是由納米粒子堆積成的。分子在其像山洞式的孔隙中傳遞比較快,因此即使是較高流速下載量也較高。另外由于硬膠是有高度交聯的聚合物組成的在水溶液中溶脹小,因此柱床穩定,而軟膠在干澡狀態和溶脹狀態下體積會相差幾倍, 軟膠的柱床高度也隨壓力增加而降低。

硬質聚苯乙烯(a)與軟膠瓊脂糖(b)為基質的層析介質SEM對比圖
 
        如下圖Uni?Mab 和MabSure 是分別以硬膠聚丙烯酸酯為基質和軟膠瓊脂糖(Agarose)為基質的Protein A 親和介質的動態載量在不同保留時間的區別。從圖中可以看出,雖然兩者靜態載量差距不大,但以硬膠為基質Uni?Mab層析介質的動態載量在高流速下比軟膠為基質MabSure的動態載量卻高很多。

納微硬質Uni?Mab與知名廠商瓊脂糖基質的Protein A親和層析介質載量對比圖
 
        硬膠還具有很高的化學穩定性,同時在生產過程中易于控制介質的形態、大小、粒徑分布及孔道結構,因此被越來越多地用于生物制藥的分離純化介質,其代表性產品是GE SOURCE 和納微Nano系列高效層析介質,這兩類層析介質都是以高交聯聚苯乙烯為基質的單分散多孔微球,并通過表面親水改性及功能化制備而成,與碳水高分子改性層析介質相比,具有粒徑小、粒徑分布窄、機械強度高、在高流速下也有較高的載量等特點,可滿足高效層析系統的需求,因此裝成的柱子具有高柱效、高分辨率、高載量、高流速、高選擇性等優點。另外由于其基質由聚苯乙烯組成,具有很強的化學穩定性和極長的壽命等特點,是比較理想的層析介質,因此這些層析介質已越來越多地用于生物制藥的精細分離純化。
軟膠與硬膠壓力與流速的關系

三、單分散高效層析介質的制備技術

       GE 是全球第一家提供商業化的單分散聚苯乙烯層析介質,其商品名是SOURCE。但GE公司本身并不具備生產單分散聚苯乙烯多孔微球的技術,GE單分散聚苯乙烯微球由Dynal 公司獨家提供。 Dynal 公司單分散聚苯乙烯多孔微球的制備方法是利用挪威科學家Ugelstand等人發明的多步種子聚合法制備(US Patent No.4530956)。
 

Ugelstad 多步種子溶脹聚合制備單分散性微球的示意圖
 
        Ugelstad 種子法可以直接用來制備一定粒徑范圍的單分散聚合物微球,克服了傳統懸浮聚合法合成的微球粒徑分布寬(見下圖),需要經過復雜的分級篩分工藝才能獲得滿足窄分布應用要求的層析介質。而分級篩分方法工藝復雜、周期長、產率低,并且會產生大量的不合格微球并造成對環境的污染。


懸浮聚合法合成“Gaussin”分布微球的示意圖

        Ugelstad的多步種子聚合技術也存在許多缺點:如種子需要有機溶劑活化,活化周期長,工藝復雜,生產周期長,大規模生產難度大等特點,并且制備的微球粒徑和孔徑范圍有局限性。納微發明的邊溶脹邊聚合種子制備微球技術克服了現有Ugelstand多步種子聚合法制備單分散微球的缺點。可用于精確制備大小可控,尺寸均一,單分散聚合物微球;且反應周期短;工藝簡單,適用于大規模生產,還容易控制微球材料組成、形態、孔徑大小和比表面積等。

邊溶脹邊聚合種子制備單分散性微球的示意圖
 
        邊溶脹邊聚合種子技術制備的聚苯乙烯/二乙烯基苯微球可直接用于蛋白分離的反相介質,這些微球如果要用于離子交換、分子篩等分離方式,一般要對微球表面進行親水層修飾或表面功能化。這些表面修飾和功能化的主要目的就是引入具有一定密度的功能基團,降低蛋白與微球表面的非特異吸附,提高分離的效果和選擇性,保持蛋白的活性及提高蛋白的回收率。這些功能團還必須具有化學和pH穩定性。用作分離介質的聚合物微球尤其是聚苯乙烯微球為了保持一定的機械強度,一般都是高度交聯,因此化學惰性較高,引入的功能團密度有一定的難度。納微通過表面可控表聚合的方法在聚合物微球表面均勻涂敷一層厚度可控的親水層,然后通過化學反應引人高密度的功能團。使所獲得的蛋白質微球分離介質具有高分辨率、高載量、高流速、高選擇性和較底的非特異性吸附等優點,是理想的蛋白分離介質。納微已成功地生產出高性能離子交換、疏水及親和層析介質。

聚苯乙烯表面功能化制備各種層析介質的示意圖

四、納微單分散聚合物層析介質的優勢

        納微利用領先的單分散聚合物微球專利制備技術成功地開發出種品規的單分散高效聚合物層析介質。納微生產的單分散聚合物層析介質在選擇范圍,規模化程度及穩定供應方面與GE SOURCE 系列產品相比具有明顯優勢:
1.  更大粒徑范圍的選擇
       GE SOURCE 層析介質的主要粒徑規格有3、5、10、15、30微米;而納微單分散聚苯乙烯微球的常規粒徑規格有2、3、 5、10、15、20、30、40、50微米。對于傳統懸浮聚合法合成多分散微球屬于Up-Down 模式(由大往小),微球直徑越大越容易做,而種子法合成單分散微球則是Bottom-Up 模式(由小往大)因此球的尺寸越大越難做,由于Ugelstad的多步種子聚合技術用于生產微球時需要多步溶漲且時間長,在溶漲過程中,顆粒越大越不穩定,因此利用該方法生產粒徑大的微球難度越大,目前GE能提供商業化單分散層析介質最大的粒徑尺寸只有30微米,而納微商業化的單分散聚苯乙烯微球最大的粒徑可以達到50微米,單分散聚甲基丙烯酸酯微球則可達到80微米。 因此納微先進的單分散微球制備技術為客戶提供更大粒徑范圍的選擇,可以滿足客戶更廣泛的需求。

不同粒徑單分散色譜填料掃描電鏡圖
2.  更多材質種類的單分散介質
       目前GE 提供的SOURCE 系列單分散聚合物層析介質只有聚苯乙烯一種基質,而聚丙烯酸酯為基質的層析介質由于親水性能好,表面易于修飾及功能化因此被廣泛地用于生物醫藥分離純化,如日本Tosoh 公司生產的Toyopearl 系列層析介質就是以聚丙烯酸酯為基質,但所有Toyopearl 系列層析介質都是用傳統懸浮聚合法合成的,粒徑分布較寬。納微不僅可以提供SOURCE 類聚苯乙烯單分散層析介質,也可以提供Toyopearl類聚丙烯酸酯單分散層析介質。
3.更多的孔徑范圍選擇
       介質的分離性能除了與粒徑大小和分布有關外,與孔徑的結構和大小也有極大的關系。孔徑的結構和大小不僅影響層析介質的載量還會影響它的選擇性因此控制孔徑結構和大小是生產高效介質的關鍵技術之一。GE SOURCE 層析介質的孔徑只有一種1000 ?選擇,這種孔徑的介質比較適合于蛋白類大分子的分離純化,但對于中小分子如多肽類就不是很合適。因為同樣的孔容積條件下,孔徑越大,比表面積越小,而比表面積大小與載量有關,有效比表面積越大載量越大。因此對于多肽或小分子選擇小孔徑比較合適。納微常規孔徑可選擇100、300、500、1000 ?,也可根據客戶的需求定制特殊孔徑的層析介質如4000 ?孔徑的介質。

不同孔徑色譜填料的掃描電鏡SEM圖
4.  更大的生產規模
       納微已建成的單分散層析介質的生產基地,每個批次可生產500升單分散層析介質,月生產量15000升。
5.  提供更多的定制化和應用開發服務
     納微可根據客戶需求提供定制化高效層析介質,并為客戶開發分離純化解決方法。

五、應用案例

         納微層析介質在分離生物分子(如蛋白質、核酸、多肽、多糖等)方面,表現出更高的分辨率、更高的效率和回收率。下圖為納微NanoSP離子交換層析介質對蛋白的分離效果圖。(色譜柱: 4.6 mm I.D × 250 mm, PEEK.;樣品: 1. Ribonuclease A (10 mg/mL) 2. Cytochrome C (4 mg/mL) 3. Lysozyme (2.5 mg/mL);進樣體積: 20 μL;緩沖液A: 20 mM PBS (pH 6.8)  緩沖液B: 20 mM PBS + 0.5 M NaCl (pH 6.8);梯度: 10CV linear gradient from 100% A to 100% B;流速: 1.0 mL/min (360 cm/h);檢測器: AKTA Purifier (UV @ 280 nm) )

納微NanoSP-10L對蛋白的分離效果圖

六、產品目錄


七、蘇州納微科技有限公司簡介

          蘇州納微科技有限公司是專門從事高精度、高性能和高附加值納微米球材料的研究、生產、銷售的國家高新技術企業。已申請25項納微米球材料制備和應用發明專利。納微生產的微球不僅具有精確的粒徑大小、高度的粒徑均一性,而且可以對微球形態、孔徑結構、比表面積及表面功能基團進行調控。微球基質涵蓋了從無機氧化物(如氧化硅, 四氧化三鐵等)、到有機高分子(聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯等)及高分子/無機復合材料,可以滿足實驗室科研和大規模制造的各種需求。
       納微擁有現代化的生產設施、先進的分析儀器以及可靠的質量控制體系,可以確保產品的質量、良好的批次間重復性和大規模生產能力。納微已通過ISO9001:2008質量管理體系認證。目前已在園區納米城建成超過13000平米現代化生產廠房和研發中心,現有員工120人,研發團隊近40人,其中10人具有博士學位,包括5位在美國學習和工作多年的科學家。
納微已承擔國家發改委生物醫藥發展專項、國家科技型中小企業技術創新基金、國家十二五科技支撐計劃項目、江蘇省成果轉化專項資金、江蘇省科技支撐計劃等多項國家省市級科研項目;分別榮獲中國僑界貢獻獎、江蘇五一勞動獎章、蘇州市科學技術進步獎、蘇州市十佳魅力科技人物;納微已建成蘇州市納微米材料工程技術研究中心、蘇州市企業技術中心、蘇州市工業園區博士后創新實踐基地等。
       納微科技秉持“以創新贏尊重得未來”的理念,憑借持續不斷的創新,成為全球納米微球技術的領跑者, 并將微球的應用不斷地拓展到更多的應用領域。 納微科技的使命就是通過創新來賦予納米微球新的光、電、磁等各種功能, 使它為人類創造無限可能,以滿足生物制藥,光電顯示,醫療診斷,食品安全檢測等產業的關鍵材料和技術的需求。

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